Останні відкриття ілюструють, як РНК -полімераза взаємодіє з ДНК, щоб ініціювати транскрипцію, зафіксовану за мілісекунди за допомогою передових методів мікроскопії. Цей прорив дає нове розуміння механізмів регуляції експресії генів, допомагаючи вирішити давні дебати в цій галузі.
Кожна жива клітина транскрибує ДНК в РНК. Цей процес починається, коли фермент РНК-полімераза (РНКП) приєднується до ДНК. Протягом кількох сотень мілісекунд подвійна спіраль ДНК розкручується, утворюючи транскрипційний міхур, що дозволяє скопіювати один відкритий ланцюг ДНК у комплементарний ланцюг РНК.
Як RNAP досягає цього успіху, в основному невідомо. Знімок RNAP під час відкриття цієї бульбашки надав би велику кількість інформації, але процес відбувається надто швидко, щоб сучасна технологія могла легко візуалізувати ці структури. Тепер нове дослідження в Nature Structural & Molecular Biology описує РНК E. coli під час відкриття бульбашки транскрипції.
Результати, отримані протягом 500 мілісекунд після змішування РНКП з ДНК, проливають світло на фундаментальні механізми транскрипції та відповідають на давні питання про механізм ініціації та важливість його різних етапів. «Це перший раз, коли хтось зміг зафіксувати тимчасові транскрипційні комплекси під час їх формування в режимі реального часу», — каже перший автор Рут Саекер, дослідницький фахівець у лабораторії Сета Дарста в Рокфеллері. «Розуміння цього процесу має вирішальне значення, оскільки це головний регуляторний крок у експресії генів».
Безпрецедентний вид
Дарст був першим, хто описав структуру бактеріальної РНКП, і виявлення її тонкощів залишається основною метою його лабораторії. Хоча десятиліттями роботи було встановлено, що зв’язування РНКП із певною послідовністю ДНК запускає низку кроків, які відкривають міхур, те, як РНКП розділяє ланцюги та позиціонує один ланцюг у його активному місці, залишається гаряче обговореним.
Рання робота в цій галузі показала, що відкриття бульбашок діє як критичне уповільнення процесу, диктуючи, як швидко РНКП може переходити до синтезу РНК. Пізніші результати в цій галузі поставили під сумнів цю точку зору, і з’явилося кілька теорій про природу цього кроку, що обмежує швидкість. «З інших біологічних методів ми знали, що коли RNAP вперше стикається з ДНК, він створює купу проміжних комплексів, які сильно регулюються», — каже співавтор Андреас Мюллер, докторант лабораторії. «Але ця частина процесу може відбутися менш ніж за секунду, і ми не змогли захопити структури за такий короткий проміжок часу».
Щоб краще зрозуміти ці проміжні комплекси, команда співпрацювала з колегами з Нью-Йоркського центру структурної біології, які розробили роботизовану струменеву систему, яка могла б швидко підготувати біологічні зразки для кріоелектронного мікроскопічного аналізу. Завдяки цьому партнерству команда зафіксувала комплекси, які утворюються в перші 100-500 мілісекунд зустрічі RNAP з ДНК, отримавши достатньо детальні зображення чотирьох різних проміжних комплексів для аналізу.
Вперше чітке уявлення про структурні зміни та проміжні продукти, які утворюються на початкових стадіях зв’язування РНК-полімерази з ДНК, стало фокусом. «Ця технологія була надзвичайно важливою для цього експерименту», — каже Саекер. «Без можливості швидко змішувати ДНК і РНКП і знімати їх зображення в реальному часі, ці результати не існують».
Зайнявши позицію
Вивчивши ці зображення, команді вдалося окреслити послідовність подій, які показують, як RNAP взаємодіє з ланцюгами ДНК, коли вони відокремлюються, на небачених раніше рівнях деталізації. Коли ДНК розкручується, РНКП поступово захоплює один із ланцюгів ДНК, щоб запобігти повторному об’єднанню подвійної спіралі. Кожна нова взаємодія змушує РНКП змінювати форму, уможливлюючи утворення більшої кількості зв’язків білок-ДНК. Це включає в себе виштовхування однієї частини білка, який блокує ДНК від входу в активний центр РНКП. Таким чином утворюється стабільна бульбашка транскрипції.
Команда припускає, що кроком, що обмежує швидкість транскрипції, може бути розташування ланцюга шаблону ДНК в активному центрі ферменту РНКП. Цей крок передбачає подолання значних енергетичних бар’єрів і перегрупування кількох компонентів. Майбутні дослідження будуть спрямовані на підтвердження цієї нової гіпотези та вивчення інших етапів транскрипції.
«Ми розглядали лише найперші кроки цього дослідження», — каже Мюллер. «Далі ми сподіваємося розглянути інші комплекси, пізніші часові точки та додаткові кроки в циклі транскрипції».
Окрім вирішення суперечливих теорій про те, як захоплюються ланцюги ДНК, ці результати підкреслюють цінність нового методу, який може захоплювати молекулярні події, що відбуваються протягом мілісекунд у реальному часі. Ця технологія дозволить проводити багато інших досліджень такого роду, допомагаючи вченим візуалізувати динамічні взаємодії в біологічних системах.
«Якщо ми хочемо зрозуміти один із найфундаментальніших процесів у житті, те, що роблять усі клітини, нам потрібно зрозуміти, як регулюються його прогрес і швидкість», — каже Дарст. «Коли ми це дізнаємося, ми матимемо набагато більш чітке уявлення про те, як починається транскрипція».
